[ Ana Sayfa | Amaç ve Kapsam | Yayın Kurulu | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazım Kuralları | İletişim ]
2017, Cilt 56, Sayı 4, Sayfa(lar) 183-192
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Editöre E-Posta ]
Meme kanseri kök hücrelerinde elajik asit ile indüklenmiş miRNA’ların ifadesi ve elajik asidin apoptoz üzerine etkisi
Hasan Onur Çağlar1, Sunde Yılmaz Süslüer2, Şebnem Kavaklı3, Cumhur Gündüz2, Biray Ertürk4, Ferda Özkınay4, Ayfer Haydaroğlu5
1Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kök Hücre Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye
2Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye
3Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye
4Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye
5Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye
Anahtar sözcükler: Elajik asit, meme kanseri kök hücreleri, miRNA, apoptoz
Özet
Amaç: Östrojen bağımlı meme kanseri tümör oluşumunda etkili miRNA’lar elajik asit (EA) uygulaması ile baskılanmaktadır. Ancak, EA uygulamasından sonra meme kanseri kök hücrelerindeki (MKKH) miRNA’ların ifade profillerinin düzenlenmesi hala belirsizdir. Bu çalışmada, MKKH’lerde EA-indüklenmiş apoptozun gösterilmesi ve EA uygulamasından sonra değişen miRNA ifade profilinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem: EA’nın MKKH’lerdeki sitotoksik etkisi WST-1 testi ile incelendi. EA uygulamasından sonra apoptoz ve hücre döngüsü analizleri flow sitometri ile yapıldı. EA uygulamasından sonra, MKKH’lerin miRNA ifade profilleri RT-PCR miRNA array ile tanımlandı.

Bulgular: MKKH’ler üzerinde EA’nın sitotoksik etkisi saptandı. 48. ve 72. saatlerde EA’nın IC50 konsantrasyonu 24.8 μM’dı. EA, MKKH’lerde apoptozu indüklemedi. Bununla beraber, EA’nın 24., 48. ve 72. saat uygulamalarında S fazı bloğu gözlendi. Toplamda 84 miRNA geninin 76’sının ifade profili belirlendi. hsa-miR-125b-1-3p’nin ifadesi EA uygulanmasıyla 3.59 kat arttı. Let-7 ve miR-200 aileleri dahil diğer tüm miRNA’ların ifade profili EA uygulaması nedeniyle azalış gösterdi.

Sonuç: Bu çalışmada, EA’nın MKKH’de apoptozu etkilemediği ve hsa-miR-125b-1-3p’in ifadesini arttırırken, başta hsa-miR-485-5p ve hsa-miR-328-3p olmak üzere diğer miRNA’ların ifadesinde düşmeye neden olduğu görüldü. Anormal miRNA ifade profili nedeniyle MKKH’lerin EA uygulamasına direnç gösterebileceği düşünüldü.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Giriş
    Meme kanseri kadınlar arasında en sık gözlenen kanserlerden biridir. Solunum yolu ve akciğer kanserlerinden sonra, meme kanseri kadınlar arasında kanser ilişkili ölümlerin başında yer almaktadır 1. Meme kanseri tümörleri uygulanan tedaviye karşı direnç gösterebilmektedir 2-4. Direnç oluşumu ile birlikte, meme kanseri hastalarında tümör yalnızca primer bölge ile sınırlı kalmamakta ve farklı bölgelere metastaz yapabilmektedir 5. Meme kanserinin insidans ve mortalite oranlarının yüksek olması ayrıca tedavi etkinliğindeki sınırlılıklar nedeniyle yeni kimyasal ajanlarının araştırılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Bitkisel doğal fenolik bileşiklerin kanser hücreleri üzerindeki bölünmeyi durdurucu etkisi, bu tür bileşiklerin uygulanan mevcut kanser tedavisine ek olarak kullanılabilme potansiyeline dikkat çekmektedir.

    Elajik asit (ellagic acid, EA) Myrciaria cauliflora, Juglans regia, Terminalia chebula, Sanguisorba officinalis, Punica granatum gibi bitkilerin yaprak, meyve ve tohumlarından elde edilebilen fenolik bir bileşiktir 6-10. Bitkilerde ikincil metabolit olarak oluşan elajitaninler’in (ellagitannins) hidrolizi sonucu oluşan EA, anti-inflamatuar ve anti-oksidan özelliklere sahiptir 11-13. Birçok çalışma, EA içeren bitki ekstraktlarının birçok farklı kanser hücresi için proliferasyonu baskılayıcı bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir 6,10. EA’nın MCF-7 meme kanseri hücrelerine uygulanması apoptozu indüklediği gibi hücre döngüsünü de bloke etmektedir 14. Meme kanseri hücrelerinde, EA TGF-β/Smads ve PI3K/AKT/mTOR sinyal yolakları ile ilişkili genlerin ifadesini yeniden düzenleyerek hücre bölünmesine etki etmektedir 14-16. Hücre bölünmesini baskılayıcı özelliğine ek olarak, EA vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörünün aktivesini inhibe ederek meme kanseri tümör hücrelerinin göçünü ve yeni damar oluşumunu engellemektedir 17. Bir kimyasal bileşiğin etkisi tümör dokusu içerisindeki farklı popülasyonlara göre değişebilmektedir. EA’nın etkinliği in vitro ve in vivo olarak meme kanseri hücrelerinde gösterilmiş olmasına rağmen meme kanseri kök hücrelerindeki etkinliği hala belirsizdir.

    Kanser kök hücreleri, tümör dokusu içerisinde oldukça az bir oranda bulunan ve kök hücre benzeri davranış sergileyen hücrelerdir 18. Kanser hücrelerine kıyasla, kanser kök hücrelerinin immün sistemi baskılanmış farelerdeki tümör oluşturma kapasitesi daha yüksektir. Hücre döngüsü, DNA onarımı, ilaç metabolizması gibi çeşitli hücresel mekanizmalarla ilişkili genlerin ifadesi kanser kök hücreleri ve kanser hücreleri arasında farklılıklar göstermektedir 18,19. Hücre sinyal yolakları ile ilişkili gen ifadelerinin kanser kök hücrelerinde yeniden düzenlenmesi, tedavi ajanlarına karşı daha fazla direnç gözlenmesine neden olmaktadır 18,19. Bu nedenle, konvansiyonel kanser tedavisine ek olarak kullanılabilecek ajanların kanser kök hücreleri üzerindeki etkinliğinin araştırılması gereklidir.

    Hücre sinyal yolakları ile ilişkili genlerin ifadesi çeşitli mekanizmalar yoluyla yeniden düzenlenmektedir. miRNA’lar 11~22 nükleotid uzunluğundaki protein kodlamayan RNA molekülleridir. miRNA’lar hedefindeki mRNA’ların 3’UTR bölgesine bağlanarak protein ürününe dönüşmesini engellemektedir. Protein kodlayan genlerin ifade kontrolünde rol oynayan miRNA genleri, normal meme dokusu ve meme kanseri hücreleri arasında ifade farklılıkları sergilemektedir 19. Bununla birlikte, bu farklılık meme kanser hücreleri ve kanseri kök hücreleri arasında da gözlenmektedir 20. Meme kanseri kök hücrelerinde, hücre apoptozunu indükleyici ve hücre bölünmesini inhibe eden miRNA ifadelerinin azaldığı bilinmektedir 21. Fare meme karsinogenez modelinde, EA’nın östrojen ilişkili tümör oluşumunda etkili olan anormal miRNA ifadelerini tersine çevirdiği gösterilmiştir 22. EA’nın meme kanseri kök hücrelerindeki miRNA ifadesini nasıl düzenlediği henüz bilinmemektedir. Meme kanseri kök hücrelerinde sinyal yolaklarının farklı düzeydeki aktivasyonu, EA’nın bu hücrelerdeki miRNA ifadesi üzerinde daha farklı bir etki oluşturmasına neden olabilir. Bu çalışma, EA uygulamasına bağlı olarak meme kanseri kök hücrelerindeki miRNA ifade değişimlerini ortaya çıkartmayı amaçlamıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    Hücre kültürü
    İnsan kökenli meme kanseri kök hücreleri 75 cm2’lik flask içerisinde direkt kültüre hazır bir şekilde CelProgen firmasından (San Pedro, CA, USA) temin edildi. Temin edilen meme kanseri kök hücreleri CD113, CD44, SSEA3/4, Oct-4, alkalin fosfataz ve aldehid dehidrogenaz gibi kök hücre belirteçleri bakımından pozitif özellik göstermektedir (CelProgen, Kat No: 36102-29-T75, San Pedro, CA, USA). Meme kanseri kök hücrelerinin kültürü için serum ve diğer büyüme faktörlerini içeren Human Breast Cancer Stem Cell Complete Growth Media ortamı (CelProgen, San Pedro, CA, USA) kullanıldı. Meme kanseri kök hücreleri %5 CO2 içeren nemli atmosferde 37oC sıcaklıkta inkübe edildi.

    WST-1 testi ile sitotoksitenin belirlenmesi
    EA’nın, meme kanseri kök hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin belirlenmesi için WST-1 testi (Boster Biological Technology, CA, USA) kullanıldı. Çalışma öncesinde 96’lık kuyucuklu plakalara hücreler her bir kuyuda 10.000 hücre olacak şekilde aktarıldı. EA’nın, meme kanseri kök hücreleri üzerindeki sitotoksitesi doz ve zaman bağımlı olarak ölçüldü. EA (50 mg, Fluka, Sigma, USA) 165 μL DMSO içerisinde çözülerek 1M ana stok hazırlandı. EA’nın farklı konsantrasyonları (100 μM-1,6 μM) 24, 48 ve 72 saat boyunca meme kanseri kök hücrelerine uygulandı. İnkübasyon süresi dolduğunda, hücrelere WST-1 karışımından 10 μL eklendi. Bir saat boyunca kuyucuklu plakalar inkübatörde inkübe edildi. WST-1 ajanı ile inkübasyondan sonra, örneklerin 450 nm dalga boyundaki absorbans değerleri ELISA okuyucu (Thermoscientific, Multiskan FC, Finland) ile alındı. Referans dalga boyu 620 nm olarak belirlendi. EA’nın uygulanmadığı hücrelerden elde edilen absorbans değerleri kontrol olarak veri normalizasyonunda kullanıldı.

    Flow sitometri ile apoptozun belirlenmesi
    Flow sitometri ile apoptozun belirlenmesi için meme kanseri kök hücreleri 6’lı kuyucuklu plakalara her bir kuyusunda 100.000 hücre olacak şekilde ekildi. EA için saptanan IC50 konsantrasyonu apoptoz çalışmasında hücrelere uygulandı. EA uygulanmayan hücreler ise kontrol grubu olarak kullanıldı. EA uygulanan ve uygulanmayan hücreler tripsin ile kaldırılarak steril falkon tüplerine alındı. Tripsin inaktivasyonu için tüplere serum içeren ortam eklendi. Hücreler 1000 g’de 10 dakika boyunca santrifüj edildi ve süpernatant alındı. Hücreler 1X PBS ile iki kez yıkandıktan sonra örneklere 1X bağlanma tamponu eklendi. Bağlanma tamponu çekilmeden, örneklere 5 μL Annexin-V/PE eklendi (BD bioscience, pharmigen, USA). Örnekler 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edildi. Örnekler 1 saat içerisinde flow sitometride (BD Accuri C6 flow cytometry, Becton–Dickinson, USA) okundu. Analiz için Cell Quest Software (Becton-Dickinson, USA) yazılımı kullanıldı.

    Hücre döngüsünün belirlenmesi
    Meme kanseri kök hücreleri 6’lı kuyucuklu plakalara her bir kuyuda 100.000 hücre olacak şekilde ekildi. Hücre döngüsünün belirlenmesinde, EA’nın belirlenen IC50 konsantrasyonu hücrelere uygulandı. EA uygulanmayan hücreler kontrol olarak kullanıldı. Hücreler tripsin ile kaldırılarak steril falkon tüpüne alındı ve tripsin inaktivasyonu için serum içeren ortam eklendi. Hücre barındıran falkon tüpleri 300 g’de 5 dakika boyunca santrifüj edildi. Geride kalan hücre pelleti üzerine 1 mL yıkama tamponu eklenerek örnekler yıkandı. Santrifüj ve yıkama basamakları tekrarlandı. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, hücrelere 125 μL A solüsyonu eklendi. Örnekler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edildi. A solüsyonu örneklerden çekilmeden, 100 μL B solüsyonu eklendi ve inkübasyon basamağı tekrarlandı. 100 μL soğuk (2-8 oC arasında) C solüsyonu örneklere eklenerek buzdolabında (+4 oC) inkübe edildi. Örnekler flow sitometride 3 saat içerisinde okutuldu.

    miRNA ifadesinin belirlenmesi
    EA’nın saptanan IC50 konsantrasyonu 72 saat uygulanan ve herhangi bir uygulamaya maruz bırakılmayan meme kanseri kök hücrelerinden total RNA izolasyonu yapıldı. Total RNA izolasyonu için Qiagen miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) kullanıldı. Deney basamakları üretici firmanın protokolüne göre gerçekleştirildi. EA uygulanan ve uygulanmayan hücrelerden izole edilen total RNA miktarı Thermo Nanodrop 1000 spektrofotometre (Thermo Scientific, Wilmington, USA) ile ölçüldü. İzole edilen total RNA’ların yalnızca olgun miRNA’ları cDNA’ya sentezlendi. Total RNA örneklerindeki olgun miRNA’ların cDNA’ya çevrimi için miScript II reverse transcriptase RT kit (Qiagen, Hilden, Germany) kullanıldı. cDNA sentez basamağında reaksiyon içeriği ve deney basamakları üretici firmanın protokolüne göre gerçekleştirildi. cDNA sentezini gerçekleştirmek için örnekler 37oC’de 1 saat inkübe edildi. Ters transkriptaz (revers transcriptase) enziminin inaktivasyonu için sıcaklık 95oC’ye yükseltildi ve örnekler 5 dakika boyunca inkübe edildi.

    Olgun miRNA’lardan cDNA kalıpları elde edildikten sonra RT-PCR array aşamasına geçildi. EA uygulamasına bağlı olarak gözlenecek miRNA ifade profili değişimi miScript miRNA PCR Array Human Breast Cancer (kat no: MIHS-109Z, Qiagen, Germany) ile tanımlandı. RT-PCR array kuyucuklu plakaları meme kanseri ile ilişkili fonksiyonu bilinen 84 miRNA’ya göre tasarlandı. Her bir kuyucuk farklı bir miRNA’ya ait PCR primerini içermektedir. PCR reaksiyon karışımı 1.375 mL 2X Quanti Tect SYBR Green PCR, 0.275 mL 10X miScript Universal solüsyonu, 1 mL RNase içermeyen su ve 40 μL cDNA ile hazırlandı. PCR karışımı hazırlandıktan sonra 96 kuyucuklu plakalara aktarıldı. Ardından RT-PCR reaksiyonu başlatıldı. RT-PCR reaksiyonunun ısıl koşulları Tablo-1’de yer almaktadır. Veri analizinde 2-ΔΔCt formülü kullanıldı. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A ve RNU6-2 miRNA genleri normalizasyon için kontrol genleri olarak seçildi. İfade profili saptanan miRNA’ların sinyal yolakları içerisindeki ortak etkisi DIANA miRPath v2.0 veri tabanı ile incelendi 23. Kullanılan veri tabanı, Tarbase veri tabanı üzerinden olası miRNA-mRNA ilişkisini göstermekle birlikte miRNA hedefindeki sinyal yolaklarını da KEGG veri tabanı üzerinden sergilemektedir 23. Çoklu miRNA sayısının ortak hedef aldığı sinyal yolağına ilişkin p değeri, veri tabanı tarafından Fisher’ın kombine olasılık yöntemi (Fisher’s combined probability method) ile bulundu 23. p değeri 0.05’den küçük olan sinyal yolağı-miRNA sayısal etkileşimi anlamlı olarak kabul edildi.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: RT-PCR İçin Uygulanan Isı Koşulları

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    Elajik asidin sitotoksik etkisi
    t EA’nın 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM ve 1.6 μM’lık konsantrasyon aralıklarındaki sitotoksik etkisi (24, 48 ve 72 saatlik) meme kanseri kök hücre hattında araştırılmıştır. İlk 24 saatlik uygulamada, EA’nın meme kanseri kök hücreleri üzerinde her hangi bir sitotoksik etkisi bulunmadı. Bununla birlikte, 48. ve 72. saatlerde meme kanseri kök hücreleri üzerinde sitotoksik etki gözlendi. EA’nın 48. ve 72. saatlerde saptanan IC50 konsantrasyonu 24.8 μM’dır (Şekil-1).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: Elajik asidin meme kanseri kök hücrelerinde 24., 48. ve 72. saatlerdeki sitotoksik etkisi. Elajik asidin 48. ve 72. saatlerdeki IC50 konsantrasyonu 24.8 μM’dır.

    Elajik asit apoptozu indüklemez
    Meme kanseri kök hücrelerine 25 μM EA uygulanarak 24, 48 ve 72. saatlerdeki apoptototik hücre yüzdeleri flow sitometri ile ölçüldü. EA uygulanmayan kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi %99.5 iken apoptotik hücre yüzdesi %0.5 olarak saptandı. 25 μM EA uygulanan meme kanseri kök hücrelerinde 1. gün, 2. gün ve 3. gün sonunda canlı hücre yüzdeleri sırasıyla %99.2, %100 ve %99.8 olarak saptandı. EA meme kanseri kök hücrelerinde apoptozu indüklememektedir (Şekil-2).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: Elajik asid uygulamasının 1. gün (b), 2. gün (c) ve 3. gündeki (d) apoptotik etkisi. Elajik asit uygulanmayan meme kanseri kök hücreleri (a) kontrol grubu olarak kullanıldı. Elajik asidin apoptozu indükleyici etkisi gözlenmedi.

    Elajik asit S fazı bloğu etkenidir
    Hücre döngüsünün belirlenmesinde 25 μM EA 24, 48 ve 72 saatlik zaman periyodlarıyla meme kanseri kök hücrelerine uygulanmıştır. EA uygulanmayan hücreler kontrol grubu olarak belirlendi. EA uygulanan hücrelerin G1 evresi yüzde oranı azalırken S evresi yüzde oranı arttı. Kontrol grubunda hücrelerin S evresi yüzdesi %14.5 iken, EA uygulanan hücrelerde 1. gün, 2. gün ve 3. gün sonunda S evresi yüzdeleri sırasıyla %26.8, %28.5 ve %35.3 olarak saptandı. EA’nın meme kanseri kök hücrelerinde S evresi bloğuna neden olduğu bulundu (Şekil-3).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 3: Elajik asidin meme kanseri kök hücrelerinde hücre döngüsü üzerine yaptığı etki. Elajik asit uygulanmayan hücreler (a) kontrol olarak kullanıldı. Elajik asidin 24 saat (b), 48 saat (c) ve 72 saat (d) uygulandığı çalışmada S fazı hücre yüzdeleri artmıştır.

    Elajik asit uygulaması sonrası değişmiş miRNA ifade profili
    Yirmi beş μM EA uygulanan meme kanseri kök hücrelerinde 72 saat sonrasında elde edilen miRNA ifade profili saptanmıştır. EA uygulanmayan hücreler ise kontrol olarak kullanılmıştır. hsa-miR-1, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-429, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-607 ve hsa-miR-96-5p miRNA genlerinin ifadesi saptanamadı. Bu nedenle 84 miRNA geninin 76’sının ifade profili saptandı. Bu miRNA genlerinden yalnızca hsa-miR-125b-1-3p’nin ifadesinde artış gözlendi.

    EA uygulamasına bağlı olarak hsa-miR-125b-1-3p’nin ifadesi 3,59 katlık artış gösterdi. Diğer miRNA genlerinin tamamında ifade azalışı saptandı. hsa-miR-485-5p ve hsa-miR-328-3p miRNA genlerinin en fazla azalan ifadeye sahip olduğu saptandı. miRNA genlerinin listesi ve EA uygulaması sonrası oluşan ifade profilleri Şekil-4’de verilmiştir. İfade azalışı gösteren miRNA’ların (10 kat ve üstü ifade azalışı) hedefindeki sinyal yolaklarının belirlenmesinde DIANA miRPath v2.0 veri tabanı kullanıldı. Veri analizi için endotelyal büyüme faktörü (hsa04012), kanser ilişkili (hsa05200), hücre döngüsü (hsa04115), p53 (hsa04115), insülin reseptör (hsa04910) ve TGF-beta sinyal (hsa04350) yolakları seçildi. Veri tabanında incelenen miRNA genlerinin 36’sından 17’sinde kanser ilişki sinyal yolağındaki genleri hedeflendiği saptandı (p=0.0000534). Biyoinformatik analize ilişkin veriler Şekil-5 ve Şekil-6’da sunulmuştur.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 4: miRNA ifadelerinin elajik asit 72 saat uygulamasından sonra meme kanseri kök hücrelerindeki ifade profilleri. Kırmızı renk ifade azalışını, yeşil renk ise ifade artışını temsil etmektedir.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 5: On kat ve üstü ifade azalışı sergileyen miRNA’ların hedeflediği sinyal yolakları. Şekilde mor kutucuk içerisindeki rakamlar her bir miRNA’nın belirtilen sinyal yolağı içerisindeki protein sentezleyen hedef gen sayısını vermektedir. Bazı miRNA’lar sentez yolağı içerisinde birden fazla mRNA’yı hedefleyebilmektedir. Şekildeki p değeri listedeki sinyal yolağı ve sinyal yolağını hedefleyen miRNA sayısı ilişkisini belirtmektedir.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 6: Elajik asit uygulamasına bağlı olarak ifadesi azalan miRNA’ların kanser ilişkili sinyal yolağı (hsa05200) içerisindeki gen hedefleri. Yeşil renk genlerin miRNA hedefi olmadığını göstermektedir. Sarı renk, sinyal yolağındaki genin analiz edilen miRNA’lardan sadece birinin hedefi olduğunu göstermektedir. Turuncu renk, sinyal yolağındaki genin analiz edilen miRNA’lardan birden fazlasının hedefi olduğunu göstermektedir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Çeşitli çalışmalarda, bitkisel kökenli doğal bir fenolik molekül olan EA’nın hücreler üzerinde anti-oksidan ve anti-inflamatuar etkilere sahip olduğu vurgulanmaktadır 11,13,24. EA ve diğer fito-kimyasalları içeren bitki ekstraktları meme kanseri hücrelerinde bölünmeyi durdurmakta ve apoptozu indüklemektedir 10,14. Ekstrakt içeriklerinin HPLC metodu ile incelenmesi, EA’nın diğer moleküllere göre daha fazla bulunduğunu ortaya çıkarmıştır 6,25. EA’nın tek başına meme kanseri hücrelerine uygulandığı çalışmalarda da hücre döngüsünün baskılandığı ve apoptozun meydana geldiği bildirilmiştir 14. Meme kanseri hücrelerinin aşırı bölünmesinden sorumlu aromataz ve telomeraz enzimlerinin aktiviteleri de EA tarafından düşürülmektedir 26,27. Buna ilaveten, EA meme kanseri tümör modelinde hücre göçü ve yeni damar oluşumunu engellemektedir 17. EA meme kanseri hücreleri üzerinde kemoprevantif ajan etkisi göstermesine rağmen, ilaç direnci mekanizmasına sahip meme kanseri kök hücreleri üzerindeki etkisi farklı veya sınırlı olabilir.

    Bu çalışmada, EA’nın meme kanseri kök hücreleri üzerindeki etkinliği araştırılmıştır. EA’nın 24, 48 ve 72 saat boyunca uygulandığı sitotoksite deneyinde, 24. saatte herhangi bir sitotoksik etki saptanmadı. Meme kanseri kök hücrelerinde uygulama zamanının artışına bağlı olarak EA’nın sitotoksik etki gösterdiği bulundu. 48. ve 72. saatlerdeki IC50 konsantrasyonu 24,8 μM olarak saptandı. Chen ve ark. 14, EA’nın ilk 24 saat içerisinde MCF-7 meme kanseri hücreleri için sitotoksik (IC50 = 66.18 μM; 20 μg/mL) etkiye sahip olduğunu bildirmiştir. Dai ve ark. 28, wnt-1 genini içeren fare meme tümör virüsü (mouse mammary tumor virüs) yardımıyla fare meme kanser kök hücresi elde etmişlerdir. Fare meme kanseri kök hücrelerinde ise, EA 24. saatte sitotoksik etki oluşturmamasına karşın 48. ve 72. saatlerde sitotoksik etki oluşturmuştur 28. Bu bakımdan, EA meme kanseri hücreleri ve meme kanseri kök hücreleri arasında farklı sitotoksik etkiye sahip olabilir. Chen ve ark. 14, çalışmasına benzer bir şekilde, Dai ve ark. 28 da EA’nın fare meme kanseri kök hücrelerinde apoptozu ve G0/G1 hücre bloğunu arttırmasının sitotoksik etkiye neden olduğunu savunmaktadır.

    Bu çalışmada, saptanan IC50 konsantrasyonundaki EA meme kanseri kök hücrelerine 24, 48 ve 72 saat uygulandıktan sonra apoptoz ve hücre döngüsü analizi yapıldı. Sitotoksik konsantrasyon uygulanmasına rağmen, meme kanseri kök hücrelerinin apoptotik hücre yüzdesinde artış meydana gelmedi. Bununla birlikte, EA’nın hücre döngüsünü S fazında durdurduğu saptandı. Dai ve ark. 28 aksine, EA’nın apoptozu indüklemediği ve sadece hücre döngüsünde etkili olduğu saptandı. Dai ve ark. 28, sitoktoksite dışındaki diğer çalışmalarını, nar bitkisinden elde edilen bitki ekstraktını fare meme kanseri kök hücrelerine uygulayarak gerçekleştirmiştir. EA’nın bitki ekstraktı içerisindeki farklı fito-kimyasallar ile sinerjistik etki gösterdiği bilinmektedir 29,30 Dolasıyla, EA’nın tek başına meme kanseri kök hücreleri üzerinde apoptotik etkisi olmayabilir. Bu çalışmadan elde edilen veriler, EA’nın meme kanseri kök hücrelerinde sitotoksik etkisinin değil sitostatik etkisi olabileceğini göstermektedir.

    Hücresel farklılaşma, hücre invazyonu ve göçü, ilaç direnci, apoptozis ve kök hücre özelliklerinin korunması gibi birçok farklı mekanizmada miRNA’lar hedefindeki genlerin ifadesini düzenleyerek rol oynamaktadır 31-35. miRNA’ların ifadesi meme kanseri hücreleri ve meme kanseri kök hücreleri arasında farklılıklar sergilemektedir 20. Bu nedenle, meme kanseri kök hücrelerindeki miRNA’ların anormal ifadeleri EA’nın etkinlik farklılığının bir nedeni olabilir. EA’nın 72 saat uygulanmasına bağlı olarak meme kanseri ilişkili miRNA’ların ifade profilleri saptandı. EA uygulamasına bağlı olarak sadece hsa-miR-125b-1-3p’nin ifadesi artış gösterdi. Diğer miRNA genlerinin tamamında ise ifade azalışı saptandı. İfadesi 10 kat ve üstü azalış sergileyen 36 miRNA’nın hedefledikleri sinyal yolakları DIANA miRPath v2.0 veri tabanı ile incelendi. Bioinformatik inceleme sonucunda, 36 miRNA’dan 11’inin ErbB sinyal yolağı (p=0.0000119), 17’sinin kanser ilişkili sinyal yolağı (p=0.0000534), 14’ünün hücre döngüsü (p=0.00038), 10’nunun p53 sinyal yolağı (p=0.0036), 8’inin insülin reseptör sinyal yolağı (p= 0.0052) ve 9’unun TGF-β sinyal yolağındaki (p=0.012) ilişkili genleri hedeflediği saptandı.

    Let-7 ailesi miRNA’ların kötü prognoz gösteren meme kanseri hastalarında daha düşük ifade edildiği bulunmuştur 36. Kanser kök hücreleri, tümör içerisindeki diğer hücre popülasyonlarına göre Let-7 ailesi miRNA’ları daha düşük düzeyde ifade etmektedir 20. Bununla birlikte, Let-7 ailesi miRNA’ların düşmesi normal meme kanseri hücrelerini kanser kök hücrelerine transforme etmektedir 37,38. Let-7 ailesine ait miRNA’lar Oct4, Sox2, Nanog ve Tcf3 gibi genlerin mRNA ifadelerini düzenleyerek kök hücrelerin farklılaşmasını düzen-lemektedir 39. Yapılan bu çalışmada, let-7 ailesine ait tüm olgun miRNA’ların (let-7a-5p, let-7b-5p, let-7c-5p, let-7d-5p gibi) ifadesi EA’ya bağlı olarak düşmüştür. EA, Let-7 ailesi miRNA’ların ifadesini düşürerek meme kanseri kök hücre özelliklerinin korunmasına neden olabilir. Let-7 miRNA’ları siklin D1 ifadesini baskılayarak Akt1’in fosforilasyonunu azaltmaktadır 40. Bu nedenle, Let-7 radyasyon ile indüklenmiş tümör baskılanmasını arttırmaktadır 40. EA’nın Let-7 ailesine ait olgun miRNA’ların ifadelerini düşürmesi ayrıca radyoterapiye karşı direncin oluşmasında da etkili olabilir.

    TGF-β sinyal yolağı, ErbB sinyal yolağı gibi diğer sinyal yolaklarıyla ilişkili bir biçimde epitelyal-mezenkimal geçiş, apoptoz, hücre göçü ve metastazda rol oynamaktadır 41. miRNA-200 ailesi (miR-200a/b/c) miRNA’ların TGF-β sinyal yolağını düzenleyerek hücre transformasyonu, hücre proliferasyonu, hücre göçü, tümör büyümesi ve metastaz üzerinde güçlü baskılayıcı etkileri olduğu gösterilmiştir 42. miRNA-200 ailesi üyelerinin meme kanserinde epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının baskılayıcıları olduğu bilinmektedir. miRNA ailesi üyelerinin ifadesi, kök hücre fonksiyonunun devamlılığının korunabilmesi için meme kanseri kök hücrelerinde düşüktür 21,43-45. Bu çalışmada, EA uygulaması meme kanseri kök hücrelerinde miRNA-200 aile üyesi olan miR-200b-3p ve miR-200c-3p’nin ifadelerini düşürmüştür. EA’nın meme kanseri kök hücrelerindeki genel etkisi kanser kök hücre özelliklerinin korunmasını sağlamak olabilir. Kanser kök hücreleri, tümör dokusu içerisindeki diğer alt popülasyonlara göre kemoterapi ajanlarına daha fazla direnç oluşturduğu bilinmektedir. miR-200c, miR-27a, miR-181a, miR-328 ve miR-145 hücrelerde direnç mekanizmasından sorumlu ATP bağlayan kaset proteinleri ABCB1 ve ABCG2’yi baskılamaktadır 34. Bu çalışmada, bu miRNA’ların olgun formlarının ifadesi EA’ya bağlı olarak düşmüştür.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Sonuç
    Bu çalışmada, EA’nın meme kanseri kök hücrelerindeki miRNA ifade değişimleri üzerine etkisi ilk kez gösterilmiştir. EA meme kanseri hücrelerinde etkili olsa da aynı etkiye meme kanseri kök hücreleri üzerinde sahip değildir. EA meme kanseri kök hücrelerini farklılaşmadan koruyabileceği gibi bu hücreleri kemoterapi ve radyo terapiye karşı daha dirençli bir hale getirebilir. Bu nedenle, kanser tedavisi gören meme kanseri hastalarında günlük diyette EA içeren besinlerin çıkartılması önerilebilir.

    Çıkar çatışması
    Yazarlar bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

    Açıklamalar
    Bu çalışma finansal olarak EBİLTEM-TTO teknoloji transfer ofisi proje destek birimi tarafından desteklenmiştir (proje numaraları: 13-KSUAM-001 ve 13-KSUAM-002). Belirtilen projeler Ege Üniversitesi Kanserle Savaş Araştırma ve Uygulama Merkezi (KSUAM) adına desteklenmiştir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin 2015;65(1):5-29.

    2) Liu H, Liu Y, Zhang JT. A new mechanism of drug resistance in breast cancer cells: Fatty acid synthase overexpression-mediated palmitate overproduction. Mol Cancer Ther 2008;7(2):263-70.

    3) Barok M, Joensuu H, Isola J. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Res 2014;16(2):209.

    4) Hayes EL, Lewis-Wambi JS. Mechanisms of endocrine resistance in breast cancer: An overview of the proposed roles of noncoding RNA. Breast Cancer Res 2015;17:40.

    5) Weigelt B, Peterse JL, van 't Veer LJ. Breast cancer metastasis: Markers and models. Nat Rev Cancer 2005;5(8):591-602.

    6) Lee J, Kim YS, Lee J, et al. Walnut phenolic extract and Its bioactive compounds suppress colon cancer cell growth by regulating colon cancer stemness. Nutrients 2016;8(7):E439.

    7) Ambigaipalan P, de Camargo AC, Shahidi F. Phenolic compounds of pomegranate byoproducts (outer skin, mesocarp, divider membrane) and their antioxidant activities. J Agric Food Chem 2016;64(34):6584-604.

    8) Hacke AC, Granato D, Maciel LG, et al. Jabuticaba (Myrciaria cauliflora) seeds: Chemical characterization and extraction of antioxidant and antimicrobial compounds. J Food Sci doi: 10.1111/1750-3841.13405.

    9) Saleem A, Husheem M, Harkonen P, Pihlaja K. Inhibition of cancer cell growth by crude extract and the phenolics of Terminalia chebula retz. fruit. J Ethnopharmacol 2002;81(3):327-36.

    10) Wang Z, Loo WT, Wang N, et al. Effect of Sanguisorba officinalis L on breast cancer growth and angiogenesis. Expert Opin Ther Targets 2012;16 (Suppl 1):79-89.

    11) Guruvayoorappan C, Kuttan G. (+)-Catechin inhibits tumour angiogenesis and regulates the production of nitric oxide and TNF-alpha in LPS-stimulated macrophages. Innate immunity 2008;14(3):160-74.

    12) Iniguez-Franco F, Soto-Valdez H, Peralta E, Ayala-Zavala JF, Auras R, Gamez-Meza N. Antioxidant activity and diffusion of catechin and epicatechin from antioxidant active films made of poly(L-lactic acid). J Agric Food Chem 2012;60(26):6515-23.

    13) Siraj MA, Shilpi JA, Hossain MG, et al. Anti-inflammatory and antioxidant activity of Acalypha hispida leaf and analysis of its major bioactive polyphenols by HPLC. Adv Pharm Bull 2016;6(2):275-83.

    14) Chen HS, Bai MH, Zhang T, Li GD, Liu M. Ellagic acid induces cell cycle arrest and apoptosis through TGF-beta/Smad3 signaling pathway in human breast cancer MCF-7 cells. Int J Oncol 2015;46(4):1730-8.

    15) Shi L, Gao X, Li X, et al. Ellagic acid enhances the efficacy of PI3K inhibitor GDC-0941 in breast cancer cells. Curr Mol Med 2015;15(5):478-86.

    16) Zhang T, Chen HS, Wang LF, et al. Ellagic acid exerts anti-proliferation effects via modulation of Tgf-beta/Smad3 signaling in MCF-7 breast cancer cells. Asian Pac J Cancer Prev 2014;15(1):273-6.

    17) Wang N, Wang ZY, Mo SL, et al. Ellagic acid, a phenolic compound, exerts anti-angiogenesis effects via VEGFR-2 signaling pathway in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2012;134(3):943-55.

    18) Dawood S, Austin L, Cristofanilli M. Cancer stem cells: Implications for cancer therapy. Oncology (Williston Park) 2014;28(12):1101-7.

    19) Salvador MA, Birnbaum D, Charafe-Jauffret E, Ginestier C. Breast cancer stem cells programs: enter the (non)-code. Brief Funct Genomics 2016;15(3):186-99.

    20) Yu F, Yao H, Zhu P, et al. Llet-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell 2007;131(6):1109-23.

    21) Shimono Y, Mukohyama J, Nakamura S, Minami H. MicroRNA regulation of human breast cancer stem cells. J Clin Med doi: 10.3390/jcm5010002.

    22) Munagala R, Aqil F, Vadhanam MV, Gupta RC. MicroRNA ‘signature’during estrogen-mediated mammary carcinogenesis and its reversal by ellagic acid intervention. Cancer Lett 2013;339(2):175-84.

    23) Vlachos IS, Kostoulas N, Vergoulis T, et al. DIANA miRPath v.2.0: Investigating the combinatorial effect of microRNAs in pathways. Nucleic Acids Res 2012 [cited 04 Sept 2016]. Available from: http://nar.oxfordjournals.org/content/40/W1/W498.long

    24) Atta Ur R, Ngounou FN, Choudhary MI, et al. New antioxidant and antimicrobial ellagic acid derivatives from Pteleopsis hylodendron. Planta Med 2001;67(4):335-9.

    25) Venkataramanamma D, Aruna P, Singh RP. Standardization of the conditions for extraction of polyphenols from pomegranate peel. J Food Sci Technol 2016;53(5):2497-503.

    26) Adams LS, Zhang Y, Seeram NP, Heber D, Chen S. Pomegranate ellagitannin-derived compounds exhibit antiproliferative and antiaromatase activity in breast cancer cells in vitro. Cancer Prev Res 2010;3(1):108-13.

    27) Strati A, Papoutsi Z, Lianidou E, Moutsatsou P. Effect of ellagic acid on the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) alpha+beta+transcript in estrogen receptor-positive MCF-7 breast cancer cells. Clin Biochem 2009;42(13-14):1358-62.

    28) Dai Z, Nair V, Khan M, Ciolino HP. Pomegranate extract inhibits the proliferation and viability of MMTV-Wnt-1 mouse mammary cancer stem cells in vitro. Oncol Rep 2010;24(4):1087-91.

    29) Kumar D, Basu S, Parija L, et al. Curcumin and ellagic acid synergistically induce ROS generation, DNA damage, p53 accumulation and apoptosis in HeLa cervical carcinoma cells. Biomed Pharmacother 2016;81(1):31-7.

    30) Mertens-Talcott SU, Percival SS. Ellagic acid and quercetin interact synergistically with resveratrol in the induction of apoptosis and cause transient cell cycle arrest in human leukemia cells. Cancer Lett 2005;218(2):141-51.

    31) Garofalo M, Croce CM. Role of microRNAs in maintaining cancer stem cells. Adv Drug Deliv Rev 2015;81:53-61.

    32) Ali Hosseini Rad SM, Bavarsad MS, Arefian E, Jaseb K, Shahjahani M, Saki N. The Role of microRNAs in Stemness of Cancer Stem Cells. Oncol Rev 2013;7(1):e8.

    33) Zhou N, Mo YY. Roles of microRNAs in cancer stem cells. Front Biosci (Schol Ed) 2012;1(4):810-8.

    34) Gomes BC, Rueff J, Rodrigues AS. MicroRNAs and cancer drug resistance. Methods Mol Biol 2016;1395:137-62.

    35) Chen W, Zhou S, Mao L, et al. Crosstalk between TGF-beta signaling and miRNAs in breast cancer metastasis. Tumour Biol 2016;37(8):10011-9.

    36) Hu X, Guo J, Zheng L, et al. The heterochronic microRNA let-7 inhibits cell motility by regulating the genes in the actin cytoskeleton pathway in breast cancer. Mol Cancer Res 2013;11(3):240-50.

    37) Iliopoulos D, Hirsch HA, Struhl K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6 links inflammation to cell transformation. Cell 2009;139(4):693-706.

    38) Iliopoulos D, Hirsch HA, Wang G, Struhl K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(4):1397-402.

    39) Melton C, Judson RL, Blelloch R. Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells. Nature 2010;463(7281):621-6.

    40) Sun H, Ding C, Zhang H, Gao J. Let7 miRNAs sensitize breast cancer stem cells to radiationinduced repression through inhibition of the cyclin D1/Akt1/Wnt1 signaling pathway. Mol Med Rep 2016 doi: 10.3892/mmr.2016.5656

    41) Zhao B, Chen YG. Regulation of TGF-beta Signal Transduction. Scientifica 2014;2014:874065.

    42) Humphries B, Yang C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget 2015;6(9):6472-98.

    43) Gill JG, Langer EM, Lindsley RC, et al. Snail and the microRNA-200 family act in opposition to regulate epithelial-to-mesenchymal transition and germ layer fate restriction in differentiating ESCs. Stem cells 2011;29(5):764-76.

    44) Wang G, Guo X, Hong W, et al. Critical regulation of miR-200/ZEB2 pathway in Oct4/Sox2-induced mesenchymal-to-epithelial transition and induced pluripotent stem cell generation. Proc Natl Acad Sci USA 2013;110(8):2858-63.

    45) Shimono Y, Zabala M, Cho RW, et al. Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell 2009;138(3):592-603.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Sonuç
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Editöre E-Posta ]